划重点：
1.iPSC培养历程中不建议使用抗生素，抗生素会影响细胞的活性和剖析潜能 。
2.iPSC培养情况应与其它细胞隔离，两次传代后检测支原体 。
01基质胶用于多孔板的包被：
（1）将Gelnest?基质胶(干细胞专用)置于冰中并在4℃融化，使用预冷的移液管或吸头混淆基质胶至均匀状态 。
注：GelNest?基质胶是由小鼠肿瘤组织中提取的基底膜身分制备而成，包括的主要身分有层粘连卵白、IV型胶原卵白硫酸肝素糖卵白等，更含有多种多种生长因子 。这些身分可以提供细胞黏附、剖析和增殖所需的支持和信号，模拟生理情况中基底膜的特性，从而进一步模拟生理情况中的细胞信号通路和互动，提高细胞培养的乐成率和效果 。
（2）在冰上，将基质胶与DMEM培养液凭据1:80或1:100的比例混匀，例如取1mL基质胶加入80mL或100mL DMEM培养液中，使用预冷的移液管混淆至均匀状态 。
注：可凭据实验具体情况调解稀释比例 。
（3）将6孔板置于冰上，凭据每孔1mL向6孔板中加入稀释后的基质胶 。
（4）将6孔板置于37℃孵育留宿 。
注：一般情况下，孵育1小时即可使用，但留宿孵育的细胞培养效果更好 。
（5）使用前吸出未结合的基质胶 。
注：需确保移液管的尖端不会刮伤涂层外貌 。
02 Y-27632 （ROCK抑制剂）溶液的配制
将Y-27632 溶于PBS中，配制成10mM的Y-27632溶液，例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中，即得1mL 10mM Y-27632溶液 。
注：Y-27632的事情浓度为10?M 。
03配制含Y-27632的人胚胎干细胞培养液（如mTeSR?1或TeSR?-E8?）
取Y-27632溶液与mTeSR?1培养液凭据1:1000的比例混匀，例如取10?l Y-27632溶液加入10mL mTeSR?1培养液中，即得10mL含10?M Y-27632的mTeSR?1培养液 。
04 iPSC苏醒：
（1）将冻存的iPSC置于37℃水浴迅速解冻，将细胞溶液转移至离心管中，用DMEM培养液冲洗冻存管两次并转移至离心管中，与管中细胞合并，室温300×g离心5分钟 。
（2）弃上清，用2mL含Y-27632的mTeSR?1培养液重悬iPSC，随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板的1个孔中，置于培养箱中培养 。
注：建议将每支苏醒的细胞(约100万个)转移至6孔板的1个孔中培养使细胞存活率最大化 。
（3）第二天对iPSC进行换液，将含Y-27632的mTeSR?1培养液更换为不含Y-27632的mTeSR?1培养液 。
注：可使用南宫28新推出细胞苏醒仪替代原始细胞苏醒历程，细胞苏醒时间短，细胞存活率高 。
05 iPSC传代：
注：iPSC细胞生长至单层后会迅速剖析并死亡，为坚持其活性和多能性，需在长满前进行传代 。
（1）去上清，用1mL PBS洗涤1次，加入1mL适当的细胞消化液
（2）将培养板转移至培养箱中孵育3分钟 。显微镜下视察，大部分细胞脱落，若细胞仍附着，可以用手轻轻拍打培养板底部使细胞脱落 。
（3）将消化下来的细胞转移至离心管中，用DMEM培养液洗涤培养板外貌两次并转移至离心管中，与管中的细胞合并，室温300×g离心5分钟 。
（4）弃上清，用含Y-27632的mTeSR?1培养液进行重悬，随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板中，置于培养箱中培养 。
06iPSC冻存：
NEST生物样本库系列含有全规格细胞冻存管及冻存液，操作简单，宁静无菌 。
（2）参考细胞冻存液的相关办法进行细胞消化 。
（3）计数，弃上清，加入适量冻存液，以每管1mL冻存液（约100万个细胞）分装至冻存管中 。
（4）将细胞冻存管安排于可逐步降低温度的NEST程序降温盒内并安排在-80℃冰箱内，确保冷却速度约为1℃/分钟 。通常冷却速度不宜快于0.5℃/分钟 。
（5）安排在-80℃冰箱内约24小时后转移至液氮气相中生存 。
iPS细胞的乐成诱导给细胞治疗及再生医学研究开辟了全新的门路 。相信在不久的将来，iPSC技术能快速突破瓶颈，NEST也将连续研发新品，推动再生医学的蓬勃生长，为患者带来新生的希望！
