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2023-02-013198 次浏览
细胞冻存

实验质料:

基础培养基                          

血清(通例为FBS/NBS                           

无菌PBS磷酸盐缓冲液                

电动移液枪

移液枪                              

超净事情台                             

无菌二甲基亚砜(DMSO

针式滤器 (0.22μm PES) [NEST]

杯式滤器(0.22μm PES) [NEST]

15mL50mL无菌离心管[NEST]

程序降温盒[NEST]

PET/PETG方形试剂瓶[NEST]

移液管[NEST]

自动旋盖机[NEST]

盒装无菌吸头[NEST]

 

实验准备:

冻存液准备:

一般的细胞:55%基础培养基+40%牛血清(FBS/NBS+5%DMSO

重要的细胞:90%牛血清(FBS/NBS+10%DMSO

冻存液配置完成后,15ml离心管分装,4℃条件下贮存备用。若配置量较大,可分装入50ml离心管,-20℃条件下冷冻贮存。(若牛血清内保存析出沉淀物,接纳0.22μm 滤膜过滤除菌)

使用前37℃水浴加热

待冻存细胞:

使细胞冻存前,选择细胞生长状态良好,且处于对数生恒久的细胞,冻存前12~24h换新鲜培养基维持细胞状态。

实验流程:

视察待冻存细胞密度,约为80%~90%。用移液枪吸出陈腐培养基,加入无菌PBS清洗细胞1-2次,去除培养情况中的残留培养基。

加入适量对应胰酶或消化液,使胰酶没过细胞,放入培养箱消化。显微镜下视察细胞状态,胞质回缩,细胞间不再连接成片,此时加入完终止液终止消化。

用吸头轻轻奏乐细胞,形成细胞悬液,将细胞悬液1000rpm,离心3-5min。抛弃上清,加入适量预先配制好的冻存液,轻轻奏乐使细胞均匀并计数。用冻存液调理的细胞密度,使之终密度为5×106/ml1×107/ml。

用移液枪凭据预计容量,分装入细胞冻存管[NEST]中,接纳自动旋盖机[NEST]旋盖密封。

标准的冻存程序为降温速率况处-1℃~-2/ min,可将待冻存细胞凭据以下办法逐步冻存:室温→4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(留宿)→液氮恒久生存。

也可将待冻存放入程序降温盒[NEST],直接-80℃留宿,再转移至液氮生存。

 

使用到的NEST产品:

无菌二甲基亚砜(DMSO

针式滤器 (0.22μm PES) [NEST]

杯式滤器(0.22μm PES) [NEST]

15mL50mL无菌离心管[NEST]

程序降温盒[NEST]

PET/PETG方形试剂瓶[NEST]

移液管[NEST]

自动旋盖机[NEST]

盒装无菌吸头[NEST]

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