实验质料:
基础培养基
血清(通例为FBS/NBS)
无菌PBS磷酸盐缓冲液
电动移液枪
移液枪
超净事情台
无菌二甲基亚砜(DMSO)
针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST]
杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST]
15mL、50mL无菌离心管[NEST]
程序降温盒[NEST]
PET/PETG方形试剂瓶[NEST]
移液管[NEST]
自动旋盖机[NEST]
盒装无菌吸头[NEST]
实验准备:
冻存液准备:
一般的细胞:55%基础培养基+40%牛血清(FBS/NBS)+5%DMSO
重要的细胞:90%牛血清(FBS/NBS)+10%DMSO
冻存液配置完成后,15ml离心管分装,4℃条件下贮存备用。若配置量较大,可分装入50ml离心管,-20℃条件下冷冻贮存。(若牛血清内保存析出沉淀物,接纳0.22μm 滤膜过滤除菌)
使用前37℃水浴加热
待冻存细胞:
使细胞冻存前,选择细胞生长状态良好,且处于对数生恒久的细胞,冻存前12~24h换新鲜培养基维持细胞状态。
实验流程:
视察待冻存细胞密度,约为80%~90%。用移液枪吸出陈腐培养基,加入无菌PBS清洗细胞1-2次,去除培养情况中的残留培养基。
加入适量对应胰酶或消化液,使胰酶没过细胞,放入培养箱消化。显微镜下视察细胞状态,胞质回缩,细胞间不再连接成片,此时加入完终止液终止消化。
用吸头轻轻奏乐细胞,形成细胞悬液,将细胞悬液1000rpm,离心3-5min。抛弃上清,加入适量预先配制好的冻存液,轻轻奏乐使细胞均匀并计数。用冻存液调理的细胞密度,使之终密度为5×106/ml~1×107/ml。
用移液枪凭据预计容量,分装入细胞冻存管[NEST]中,接纳自动旋盖机[NEST]旋盖密封。
标准的冻存程序为降温速率况处-1℃~-2℃/ min,可将待冻存细胞凭据以下办法逐步冻存:室温→4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(留宿)→液氮恒久生存。
也可将待冻存放入程序降温盒[NEST],直接-80℃留宿,再转移至液氮生存。
使用到的NEST产品:
无菌二甲基亚砜(DMSO)
针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST]
杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST]
15mL、50mL无菌离心管[NEST]
程序降温盒[NEST]
PET/PETG方形试剂瓶[NEST]
移液管[NEST]
自动旋盖机[NEST]
盒装无菌吸头[NEST]