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2023-02-083850 次浏览
解决计划|PBMC疏散小妙招

PBMCperipheral blood mononuclear cell),外周血单个核细胞,其主要细胞类型为血液里具有单个核的细胞,主要包括淋巴细胞(T\B),单核细胞,吞噬细胞,树突状细胞和其他少量细胞类型,其中淋巴细胞占很大一部分。疏散PBMC的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除,从而能够很便当地模拟体外的血液免疫情况。从血液制备PBMC是疏散特定免疫细胞亚群之前常见的一个办法。最常用的PBMC分选要领是使用密度梯度离心液进行离心。

工具/原料

  • 全血 (以10ml为例)
  • 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
  • 蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS)
    • 外周血淋巴细胞疏散管

    要领/办法

    1.  将疏散液用移液管从疏散管嵌套的中心孔中加入:15ml的疏散管需要加入约4ml疏散液 ;50ml的疏散管需要加入约13ml疏散液,确保疏散液笼罩嵌套上方。

    2.  将抗凝样本沿管壁缓慢倒入或用移液管沿管壁缓慢加入到疏散管中。

    3.  室温下离心10min,离心力为1200 x g。

    4.  收获PBMC细胞,将疏散管中上清倒入另一洁净离心管中,疏散管中的嵌套能有效制止红细胞和粒细胞再次污染。(注意:离心后倾倒收获细胞前,也可先吸取收罗或抛弃最上层血浆层,有助于减少细胞被血小板污染。

    5.  PBS洗涤PBMC细胞,在250 x g离心力下离心10min。

    6.  按办法5重复洗涤2次,用5ml PBS缓冲液重悬细胞。


    离心后液体疏散情况(从上到下):a血浆层 ;b富集的细胞部分(PBMCs) ;c疏散液 ;d嵌套 ;e沉淀(红细胞和粒细胞)。

    注意事项

    1.  可用于人类外周血、骨髓和脐带血样本。不适用于血凝等异常样本或凌驾48小时的样本。

    2.  15ml的疏散管建议使用4-9ml样本 ;50ml的疏散管建议使用13-30ml样本。

    3.  关于安排24h以上的样本,建议离心时间加长。

    4.  离心后收获细胞前,也可先吸取收罗或抛弃最上层血浆层,有助于避免被血小板污染。

    5.  离心后倾倒上清时不要将疏散管倒置2s以上。

    6.  疏散管请勿重复使用。

    7.  离心后,细胞可能聚集在富集层以上的疏散管的管壁上。这种聚合是正常的,受样实质量、样本安排时间和抗凝剂类型的影响。此聚合与疏散管的使用无关。细胞可以通过使用移液管尖端轻刮聚集团的一侧来清除。

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