南宫28

内容概述：本研究提出了一种将Cas12bsgRNA 拆分为两个片段（即“破裂 sgRNA”）的战略。该战略利用通用骨架结构与可定制的 Spacer 区域相结合，实现了对 Cas12b 切割活性的精确调控。同时，此要领支持无需核酸扩增的 microRNA 直接检测。研究结果标明，通过优化 sgRNA 结构可有效降低脱靶效应并抑制配景切割信号，从而构建了一个具有高灵敏度和高特异性的 microRNA 检测平台。

研究配景

在基因编辑和核酸检测领域，Cas12b是一种极具潜力的 CRISPR-Cas 系统。然而，古板 sgRNA 设计易引发配景切割和脱靶效应，需更精细的活性调控战略。同时，作为重要生物标记物的 microRNA，其检测面临浓度低、结构庞大等挑战。为此，本研究旨在开发一种新型 sgRNA 架构，在实现对 Cas12b 活性精准调控的同时，支持无需扩增的 microRNA 直接检测。

实验要领与历程

• sgRNA 破裂设计：将 sgRNA 拆分为 scaffold 部分与 Spacer 部分划分表达或组装。

• 活性调控评估：通过体外Cas12b 切割实验验证差别组合，测定切割效率与配景活性。

• microRNA 检测计划建立：结合报告片段和荧光信号输出，无需逆转录扩增即可检测目标 microRNA。

• 灵敏度与特异性测试：在多种microRNA 浓度梯度中测试检测下限与选择性。

  
  

Cas12b的sgRNA和破裂sgRNA的计划概述

实验结果

• 活性调控：乐成拆分sgRNA 显著降低 Cas12b 的非特异配景切割，仅在配对正确 Spacer 后激活强信号。

• 高灵敏检测：检测下限抵达picomolar 级别，配景噪音较低。

• microRNA 特异性良好：能区分近似序列差别较小的 microRNA，通过 Spacer 定制即可切换检测目标。

  
  

结论

split sgRNA 的设计具备普适性，只需更换 Spacer 即可扩展至差别 microRNA 或 DNA 靶标，且无扩增的检测要领可以简化流程、降低本钱与污染危害。该平台具备潜力推广至临床快速诊断设备或现场检测（POCT）应用。未来可与纳米载体、光学传感设备等结合，提升整体检测便当性与应用规模。

使用改良的CRISPR-Cas12b 系统检测 miR-17、21、31 和 92a 的表达量

使用同样的检测要领检测健康人（H.D.1–5）、结直肠癌患者术前（P.D.1–5 preO） 和 术后（P.D.1–5 postO） 血浆总 RNA 中的 miR-17、21、31 和 92a 水平

Cas12b split sgRNA 要领 与古板 RT-qPCR 要领比照

论文中用到的NEST产品

胎牛血清

实验：细胞培养

涉及细胞类型：HCT116,SW480, NCM460

在本实验中，研究人员使用含FBS的培养基划分培养了结直肠癌细胞系 HCT116、SW480 及正常肠上皮细胞系 NCM460，并从中提取 microRNA。随后，他们利用开发的 split sgRNA-Cas12b 要领检测了 miR-17、miR-21、miR-31 和 miR-92a，并与古板 RT-qPCR 结果进行比照。结果显示，癌细胞中 microRNA 表达量显著高于正常细胞，两种要领结果高度一致。别的，还检测了结直肠癌患者术前术后及健康人群血浆中的 microRNA 水平，验证了其在肿瘤诊断和术后监测中的应用潜力。

NEST胎牛血清的优势

NEST胎牛血清是从牛胎中抽取的血液凝固后剩余的液体部分，通过离心去除细胞、凝固纤维卵白原和卵白以获得血清，含有许多有助于细胞生长的身分，包括：如生长因子、附着因子、激素、转运卵白、脂质、糖类、维生素等。