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2025-10-282192 次浏览
论文分享 | 南宫28细胞小室助力中山大学隶属第五医院“喷雾”抗癌，小鼠肺转移清零


文章名称：Lung metastasis and recurrence is mitigated by CAR macrophages, in-situ-generated from mRNA delivered by small extracellular vesicles

中文名称：由小型细胞外囊泡递送mRNA在体内生成的CAR巨噬细胞可显著抑制肺癌转移与复发

杂志名：nature communications

期刊影响因子：15.7
第一作者：Yuchen Xiao, Tianchuan Zhu
通讯作者：Xi Huang
宣布日期：2025.8.4

https://doi.org/10.1038/s41467-025-62506-2



研究内容

概述：

本文设计了一种吸入式的纳米递送系统：
把编码CAR（靶向间皮素）的 mRNA 放到小型细胞外囊泡（sEV）里，并在囊泡外貌装上能识别 M2 型巨噬细胞外貌受体 CD206 的单链抗体片段 。
这样吸入后，这些带有识别标记的囊泡会在肺里累积，并被M2 巨噬细胞摄取 。囊泡里的mRNA 在巨噬细胞内被翻译为 CAR 卵白，从而把这些巨噬细胞革新为有抗肿瘤吞噬能力的 CAR-M 。
与体外培养再回输的细胞疗法相比，这种原位（in-situ）生成 CAR-M 的方法，制止了庞大的细胞制造历程，并减少了全身给药导致的肝脏富集问题 。
动物实验标明：吸入给药能减少肺转移肿瘤量、延永生存，并增进免疫影象，能有效抑制肿瘤复发 。


研究配景

肿瘤的转移与复发，是导致癌症死亡的主要原因 。肺是常见的转移位点，古板的CAR-M（嵌合抗原受体革新的巨噬细胞）在治疗实体瘤上前景不错，但面临制造庞大，以及静脉注射后主要在肝脏累积以至肺可达性差等问题 。本文提出：如果能在肿瘤所在器官（肺）原位把巨噬细胞革新成CAR-M，就能避开这些问题并提升治疗效果 。



实验计划

1.sEV 设计与制备

构建表达mesothelin（MSLN）特异性 CAR 的 mRNA（CAR^{mRNA}）；并将其装载进工程化的小型细胞外囊泡（sEV） 。
在sEV 外貌整合 anti-CD206 scFv（记作 aCD206）以靶向 M2 型巨噬细胞，并通过特别修饰（如 L7Ae/C-box �？椤x43 修改等）提高 mRNA 装载与递送效率 。对 sEV 的形貌（TEM）、卵白标记（CD63、TSG101 等）和 mRNA 含量做了表征 。
2.体外验证（巨噬细胞培养与功效验证）
用骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）极化成 M2 型后，检测 sEV 的摄� 。╥nternalization）、CAR mRNA 的翻译（用 EGFP 替换 CAR 作示踪）、以及 CAR 卵白的表达（流式/免疫荧光/Western blot） 。
评估CAR-M 的功效性：对靶细胞（B16 小鼠玄色素瘤细胞构建的 MSLN 表达系）进行吞噬实验、细胞毒性实验、细胞因子释放检测等 。
3.免疫细胞互作与转录/信号通路检测
用Transwell 共培养（sEV 处理后的 BMDM 在下室，T 细胞或 DC 在上室）评估 CAR-M 对 T 细胞增殖、DC 成熟等的旁排泄/抗原呈递影响（用 CFSE 标记 T 细胞，流式剖析）  。同时用 qPCR / heatmap / western blot 检测吞噬后上调的信号通路（如 AKT、NF-κB、ERK） 。
4.体内给药与抗肿瘤疗效
在小鼠肺转移模型中比较吸入（inhalation） 与静脉注射两种给药方法的组织漫衍（Fluc 或 DiR 示踪）、巨噬细胞中 CAR 表达、肿瘤生长（生物发光、病理切片）、肿瘤微情况（流式细胞谱系剖析、细胞因子测定）和恒久复发/生存率 。


CARmRNA@aCD206 sEVs制备历程示意图


CARmRNA@aCD206在肺转移癌中的靶向递送及抗肿瘤机制 。

实验结果

1.sEV 能有效加载并携带 CAR mRNA，工程化sEV 在形貌、外貌标记与 mRNA 含量上获得良好验证 。

2.体外：aCD206-修饰的 sEV 更易被 M2 BMDM 摄取，能够在细胞内爆发 CAR（EGFP 示例证明翻译），并使巨噬细胞体现出增强的抗原特异性吞噬、释放更多促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α），在体外对 MSLN 阳性肿瘤细胞的吞噬与细胞毒性更强 。

3.免疫互作：在Transwell 共培养中，CAR-M 能通过旁排泄或抗原递呈增进 T 细胞增殖并诱导 DC 成熟（Transwell 里上室的 CFSE-标记 T 细胞与 DC 的指标显示出明显提升），提示 CAR-M 有助于激活适应性免疫并可能引起“表位扩展” 。

4.体内：吸入给药相比静脉注射能使sEV 在肺中更高富集并更有效地在肺巨噬细胞中诱导 CAR 表达（流式与组织免疫荧光证明） 。吸入CARmRNA@aCD206 sEVs能显著抑制肺转移瘤负荷（生物发光、肉眼/HE切片），延长动物生存，并爆发恒久免疫影象，同时肝脏富集问题明显缓解 。



讨论
通过将CAR mRNA 递送到肿瘤组织内的巨噬细胞，可在不进行庞大致外细胞制造的情况下爆发功效性CAR-M，从而优化生物漫衍、增强局部抗肿瘤免疫，并减少系统性副作用 。
该技术在肺转移模型上效果显著，并显示可诱导恒久免疫影象以预防复发 。作者认为该sEV 平台具有推广到其他靶抗原和组织的潜力，但要注意提升 mRNA 载入效率、特异性靶向以及临床转化中的剂量和宁静性评估 。







论文中用到的NEST产品


细胞小室


使用到的NEST产品：细胞小室

1.T 细胞增殖实验
研究人员把CFSE 标记的 T 细胞放在 Transwell 上室，把巨噬细胞（BMDM/CAR-M）放在下室，检测是否能通过排泄因子增进 T 细胞增殖 。结果显示：CAR-M 显著增强了 T 细胞的增殖能力 。
2.树突状细胞成熟实验
将未成熟DC放在上室，巨噬细胞放在下室，共培养后检测 DC 的成熟标记物 。结果显示：CAR-M 能有效增进 DC 成熟，增强免疫激活作用 。


经过与B16-MSLN 细胞共孵育预处理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 实验中对 T 细胞增殖的影响


G 经过与 B16-MSLN 细胞共孵育预处理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 实验中对树突状细胞（DC）成熟（CD11c?CD80?CD86?）的影响





NEST细胞小室的优势

   

细胞小室在细胞实验中很常用，如：共培养实验、趋化实验、细胞迁移实验、细胞侵袭以及药物转运 。其中，通透性支持物可以有效改善极性细胞的培养，因为这些支持物允许细胞从其基底面和顶面排泄和吸收分子，从而以更为自然的方法进行代谢，最洪流平地模拟体内情况以培养某些特殊的细胞系 。


?立异的边沿设计：操作简单便捷，减少细胞损伤，包管实验重复性和准确性
?PC（聚碳酸酯）膜：机械强度高，化学稳定性好，能蒙受多种实验条件，确保实验结果准确可靠，不易撕破或卷曲，且取出小室时操作便当
?PET（聚酯）膜：具有良好的化学稳定性，兼容多种溶剂情况
?兼容性好：与大部分细胞牢固、染色溶剂兼容，便于后续显微视察和恒久生存
?低吸附特性：PC膜低吸附率，减少小分子卵白和化合物的损失，确保实验数据真实可靠
?孔径规格富厚：提供0.4μm至8μm的全规格孔径，提供6孔、12孔、24孔等多种规格配套多孔板，满足差别规模的实验需求

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