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2022-11-306636 次浏览
核酸检测

一、实验室常用核酸的浓度与纯度检测

核酸浓度与纯度检测最简单常用的仪器是微量紫外分光光度计 ,代表为NanoDrop。NanoDrop分光光度计利用分子的紫外吸收特性来测定样品浓度。核酸吸收峰为260nm ,卵白样品吸收峰为280nm。别的 ,许多提取历程中残留的污染物通常在280nm和230nm处有吸收峰。[ NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN]样品浓度与吸光度成正比关系(Beer-Lambert Law) ,因此通过测定吸收峰就可以得出核酸样品的浓度。

核酸样品的纯度可以由A260/A280、A260/A230两个比值来反应。纯度较高DNA的A260/A280应在1.8左右 ,RNA在2.0左右。若DNA样品的A260/A280数值偏向2.0 ,则标明保存RNA污染 ,如有需要应使用RNA酶处理样品并纯化 ,反之亦然。A260/A230数值可以反应样品中有机物污染水平 ,一般大于2.0则较好 ,若偏低则体现产品中含胍或乙醇等有机物的污染(如表1所示)。


比值 测定样品 “纯”样品的比值规模 比值异常的原因
A260/A280 核酸 DNA: ~1.8 RNA: ~2.0 造成低比值的污染物: -卵白质 -核酸提取办法中的剩余苯酚和其他试剂
A260/A230 核酸 DNA/RNA: ~2.0-2.2  

造成低比值的污染物: -卵白质 -碳水化合物 -提取中的剩余苯酚 -剩余胍(常见于提取柱类要领) -用作辅助沉淀剂的糖原 造成高比值的原因: -空白比照有误
A260/A280 卵白 ~0.6 造成高比值的污染物: -核酸

表一 紫外吸收法反应纯度的要害比值2

DNA的浓度检测经�;嵊跋旌笮笛榈牟僮� ,浓度过高和过低都会影响PCR、酶切酶连等反应的进行。因此要进行适当稀释 ,包管反应体系中DNA终浓度在合适的规模内。
另外一种常用的核酸检测要领为荧光光度法(代表常用仪器为Qubit) ,利用核酸与靶标选择性染料结合后发光的原理来检测浓度 ,可以检测浓度很是低的样品 ,灵敏度比紫外分光光计高。该要领检测差别性质和结构的核酸时需要特定的试剂盒 ,因此本钱较高。

二、实验室核酸样品质量检测
核酸电泳是常用于检测DNA与RNA完整性的要领。将核酸样品加入琼脂糖凝胶上的加样槽后 ,通过电泳作用 ,差别巨细的核酸分子会以差别速率向正极迁移。长链、环形的核酸迁移速度比短链、线型的核酸分子慢。通过荧光染料溴乙锭或商品化染料SybrGreen、GelRed等染料染色 ,电泳结束后即可在紫外下视察核酸分子的迁移情况。与核酸巨细标准物比照即可判断核酸样品是否保存断裂或污染的情况。

NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN
NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN

核酸检测历程中可以用到的南宫28耗材:
枪头(100μL、200μL、1000μL等);微量离心管(1.5mL、2mL);PCR管类。
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